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严修和张伯苓在创校初期，克服重重困难，多方筹措资金，诚招海内外师资。办学伊始，就把高起步，要与欧美大学并驾齐驱作为目标。1923年，南开女中成立。同年，南开大学也由男中校址迁到八里台。1928年，南开小学成立。至此，南开成为一所包括四部的系列学校。
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| 南开大学化学实验室 |
20年代也是南开大学从初创向日臻成熟的过渡阶段。此时，学校的建设已初具规模。昔日芦苇丛生、荒草漫漫的八里台，变成了天津南部的风景区。在优美的环境中，青年学子们迅速成长起来。20年代的青年，具有迥然不同于过去的思想风貌。南开大学诞生在五四运动的历史潮流中。新文化运动以其锐不可当之势，使得中国社会开始新的变革。
南开是以爱国教育著称的，因此南开从一开始就成为天津学生爱国斗争的中心之一，不少人成了天津五四爱国运动的骨干和领袖，如马骏、周恩来、马千里、时子周等。周恩来是南开大学首届学生，是南开最杰出的校友，更是南开人的骄傲。校董严修和校长张伯苓很赏识他。张校长常说：周恩来是南开最好的学生。当他得知周恩来家境困难时，破例免去了他的学杂费，这在私立学校里是很少见的。
周恩来入南开大学时，正值五四反帝爱国运动如火如荼之时。他主编了《天津学生联合会报》，与邓颖超等人发起组织了青年革命团体——“觉悟社”，带领天津学生到省公署请愿。周恩来成为了天津青年学生运动的领袖，他的无私无畏的斗争精神为广大青年学生所钦佩。
1937年7月30日，天津沦陷。日本军国主义者把南开视为天津抗日的桥头堡，首先轰炸南开，大学和中学均被夷为平地。南开大学是抗战以来第一所罹劫的高等学府。南开大学被日本侵略军炸毁，被迫流亡南迁，与北京大学、清华大学在湖南长沙成立临时大学，继而再迁昆明，改名为国立西南联合大学。
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